4.ルシフェラーゼアッセイ（和賀巌）
1.はじめに
ルシフェラーゼは、ATPのエネルギーで..♪ほたるのひぃかぁりぃ～(約560nmなのだ)作る酵素です。2 生化には、北米産ほたる由来の遺伝子をつかった発現ベクター(IW作)ｂ｢くつかあります。プロモｰター活性の測定やcis- または、trans-acting elementの検出、発現プラスミドのトランスフェクション条件の決定、発現クローニングのポジコンやレポーターとしていろいろと役にたちます。CATアッセイと比較すると、高感度で、しかも簡便なので最近はいろんな有名雑誌の論文でやられています。
2.方法
( 1) plasmidのトランスフェクション
( 2) 48～72hr培養
( 3) 培養supの除去
( 4) wellの洗浄
( 5) 細胞の溶解 (24 穴プレートの場合、lysis buffer 200μl / well )
( 6) ライゼートをEppendorf tubeへうつす
( 7) 脱核(遠心15K､3min,4℃)
( 8) 上清を別のEppendorf tubeへうつす
( 9) 液シンの前に行く
(10) ﾙｼﾌｪﾘﾝmixにサンプル上清を0.5μl加える
(11) カウントをみる
(12) めでたし2 (^/^)
3.試薬
lysis buffer: 25mMTris(7.5),2mM DTT, 10%glycerol, 1% Triton X-100
ﾙｼﾌｪﾘﾝmix: ニッポンジーンのピッカジーン(Code No. PGK-L100)というキットは、はずかしいほどあまちゅあで、のうみそてんきな名前がわざわいしていて論文には記載されてませんが結構つかわれてるそうです。ばらでそろえるより、おそらく安くてむだがなくて便利なのでこれを使いましょう。
ちなみに、自作する人(きっといないだろうな～)や論文に記載する人のために、
20mM Tricine / 1.07mM (MgCO3)4Mg(OH)2-5H2O / 2.67 mM MgSO4 / 0.1mM EDTA / 33.3 mM DTT / 270μM Coenzyme A / 470 μM luciferin / 530μM ATP
4.注意事項
地下のアロカの液シンでは、プログラムNo1を使用しましょう。シングルフォトンモニターで測定するのが正しいのですが、これで簡便にはかれます。
5.参考データ
細胞; COS-7
細胞数: 5x105cells/ml (24well plate)
Vector: pCAN2 (EFpromoter+luciferase gene);
0.5μg/well(トランスフェクションは各添付資料にしたがった)
サンプル: 細胞を200μlに溶解した遠心上清を、たった0.5μl( 1/400ライゼート)
ﾙｼﾌｪﾘﾝmix: 50μl /サンプル
agent メーカー luciferase activity (count)
TRY I TRY II
- - 32±16 23±3
lipofectin ぎぶこ 277686±1500 21432±1226
DOTAP やまのうち 430±59 -
transfectam にっぽんじーん 2367600±13732 387682±18524
DEAE-dextran じまえ - 194532±47807