27.ABI 373 DNA Sequencer の使い方 BigDye 編（横溝岳彦）
Version up @1999年3月16日
ABIシーケンサーのBigDye対応編です。これまでのFSやTSは使えませんのでご注意下さい。なお、以下は、1999年3月16日現在のやり方です。下線部部分は現在第二生化内で得られている情報です。
＃１ Template Plasmidの調整(Mini-prep+PEG沈法)
１）LB(TB) 10mlにて大腸菌を終夜培養
２）集菌
３）200μlのGTEに懸濁
４）300μlの0.2M NaOH/1% SDSを加え、氷上で5分（転倒混和のこと）
５）300μlの3M KOAc, pH 4.8を加え、氷上で5分（転倒混和のこと）
６）室温で10分間遠心し、supを回収
７）RNaseを20μg/ml加え、37℃、20分
８）400μlのクロロホルムで上層を回収（Phenolはtaqを阻害するので使わな いこと）
９）等量のイソプロでDNAを沈殿させる（遠心室温10分）
１0）32μl H2Oに溶いて、8μlの4M NaCl, 40μl の13% PEG8000で沈殿させる 。（氷上20分、遠心4℃、20分）
１1）70% EtOHでwashし、TEまたは水に溶かし、吸光を測る。理想的にはこの 段階でゲルでpurityをチェックするのが望ましい。（RNA, genomeは全く見えませんでした)
#2 Qiagen精製のplasmidはPEG沈無しで読むことができます。また谷口先生によれば、Mini-prepのみでも読めるとのことです。(横溝は確認していません)
＃3 Primer
PrimerはSequenaseに使う17mer程度のものではAnnealが悪いので、少し長く作った Primerを用いる。一般的に用いられるReverse, M-20, T3, T7, KS, SK(いずれもABI用に作成して読めることを確認済み)はコントロ ール(M-21)にあわせて、0.8μMに調整して5研の-20 ℃に入っています(黒い箱でPrimer, Templateと書いてあります)。自分で作成するときのTmの目安は、2x(A+T)+4x(G+C)で50-60℃（マニュアルでは40-60となっているが 、低いと読めない）である。
＃4 Cycle sequence反応。
Reaction mixture
FS premix 8 μl
Double strand DNA 0.25-0.5 μg(pcDNA3等の長いベクターの場合は1-2 μg位使ったほうがいい)
Primer 3.2 mole (0.8 μM を4 μl )
water x μl
-----------------------------------
Total 20 μl
Hot startは必要ないが、氷上でmixして、circularの温度が96℃に上昇してからHold してTubeを差し込んですぐにstartすること。室温からstartするとMiss annealを起こしてしまい、Backgroundが高くなります。なお、FSになってからは、 Double strand DNA 0.25-0.5 μgをtemplateにします。
6研のPerkin-ElmerのThermal cycler480では#12(96度30秒、50度15秒、60度4分を 25cycle)で、機器室の9600ではFile 8(96度10秒、50度5秒、60度4分を25cycle)で反応させれば自動的にPCRを行って4℃で keepするように設定してあります。9600はoil freeでOK(micro tubeと使うこと）ですが、480はoilが必要です。
＃5 PCR反応後の精製。
これまでと少し違います。BigDyeは分子量が大きく、エタ沈の際に落ちやすいので、 取り込まれなかったDyeをいかに取り除くかが重要です。ABIは完全にエタノールを除 くために丸底のチューブを使うことを推奨していますが、横溝の経験では、角底のも ののほうがpptを失いにくいのでおすすめです。現在のところ、isopro沈が行われて います。
Tube あたり20 μl H2O, Isopropanol 60 μlを1.5 ml tubeに分注して おく。(塩は不要)
PCR productを全量移す。
室温15分。
室温遠心20分、上清を完全にのぞく。
70 % EtOH 250 μl を加え、vortex後、室温遠心5分。エタノールを完 全に除く(これは必要です)
ふたを空けて5分室温放置後、Loading buffer 3-4 microLに溶かす。全量 を泳動。
Pelletは見えないことが多いので、注意してエタ沈すること。またPelletに色( Pinkのことが多い)が付いているときはバックが高くてまず読めませんから、再度エタ沈を行うこと。
＃6 ゲル板の調整。
マニュアルでは6%であり、現在マリソルのPremix gelを使っている。長く読もうとす るとき、ゲル板の調整は大変重要で、流し込んでから、最低2時間、気温の低いとき は4時間位は放置しておいた方が望ましい。(アクリルアミドの重合が大切のようです )。
(マリソルPremixの場合--34 cmゲル、Page)スペーサーは0.4mm
マリソルのPremix gelを室温に戻す。このときureaが析出しているようなら、 しばらく放置する。（決して振ってはいけない。特に泡は要注意です。）
ゲル板を専用の洗剤でよく洗う。（傷をつけないように注意。ゲル板は1 set ６万円）
Isopro+ ケイドライでゲル板をよく磨く。
マリソルのPremix gelにAPS stickを1本加え、静かに20回転倒混和する。この とき空気が入らないように注意する。
先を切り、流し込む。上にスペーサーを入れて、サランラップで覆い、その上からクリップで止める（乾燥防止）。
そのまま2-4時間以上放置する。
(Long Ranger Single gel packの場合--48cm, Long Ranger)スペーサーは0.3mm
ゲル板を専用の洗剤でよく洗う。
Isopro+ ケイドライでゲル板をよく磨く。
Packに書いてあるとおり、良く溶解する。先を切り、ビーカーに移して30mlシリンジで吸い、静かに流し込む。
上にスペーサーを入れて、サランラップで覆い、その上からクリップで止める（乾燥防止）。
7 そのまま2-4時間以上放置する。
＃7 泳動
TBEを2l 作る。
ゲル板のテープを全てはずし、ガラスの表面を専用の洗剤で洗う。ゲルの上端は蒸留水でリンスする。
Isopro+ ケイドライでゲル板をよく磨く。
Plate checkを行い、OKなら組み立てる(マニュアル参照)。青い線が650-700程度、赤い線が2000以下になるように、PMT voltageを調整する。
サンプルを95-100℃、2 min. denature後、急速冷却しon iceにする。
再度ウェルを洗う（極めて大切）。
サンプルをロードし、start. (マニュアル参照) 各種設定を行う。サンプルの数が多いときは、一つおきにdenature、Loadを行う。
(泳動条件)
(34cm, Pageゲルの場合)
Power 26-30W(26W位の低速泳動がいいようです), Time 16Hrs, Volt 2500V, Amp. 40 mA
(48cm, Long Rangerの場合)
Power 42W, Time 18Hrs, Volt 2800V, Amp. 40 mA
マニュアルに書いていないTips
１）両端のレーンの一つ外側に4 μl のLoading bufferをのせるとSmilingを防ぐことができる。
＃8 分析
分析はマニュアルを参考にしていただきたいのですが、注意点を一つ。Gel fileを保存したくなりますが、別の名前にするとシステムが動かなくなるので、絶対に行わな いで下さい。どうしてもとっておきたい人は、自分のHard diskか、MOに入れること 。原則として泳動の翌朝には必ず解析し、データは自分で管理すること。終えたら誰かが上書きすると考えて下さい。
また、泳動後に必ずサンプルのspacingとsignalを確認しましょう。spacingがレンジ(12-15)に入っていないときは、泳動条件を変える必要があります。また、signalはGが100-200が至適です。これが二桁の場合は、plasmidの純度を上げるか、量を増やした方がいいと思います。