26.ABI 373 DNA Sequencer の使い方 FS 編（横溝岳彦）
Version up @1998年3月18日
Dye Terminater Cycle Sequencing kitがversion upし、簡単な操作で1tube reactionで400-500bp程度を読むことができるようになりました。このマニュアルだけではなく、必ずSequencerのマニュアルも読んで下さい。同時に24-36sample読めますからsampleが少ないときはお誘い合わせの上、相乗りすることをおすすめします。実際の手間はほとんどゲル板作りです。
標準的なプロトコールとしては
Day0 朝からPlasmid精製、PCR(4h),
Day1 ゲル板作り(慣れれば30 min), PCR産物の精製(30 min)、泳動(1-2 h、後は16h放置)
Day2 解析、片づけ
となりますが、頑張れば、Plasmid精製から当日中に泳動を開始することもできます。
＃１ Template Plasmidの調整(Mini-prep+PEG沈法)安いのでできるだけこれで読みましょう。
１）LB(TB) 1-2mlにて大腸菌を終夜培養
２）集菌
３）200μlのGTEに懸濁
４）300μlの0.2M NaOH/1% SDSを加え、5分放置（転倒混和のこと）
５）300μlの3M KOAc, pH 4.8を加え、5分放置（転倒混和のこと）
６）RNaseを少量加え、37℃、20分。(GTEに少量加えておいてもOK)
７）400μlのクロロホルムを加えvortex（Phenolはtaqを阻害するので使わないこと)
８）室温で10分間遠心し、supを回収
９）等量のイソプロでDNAを沈殿させる（遠心室温10分）
１0）32μl H2Oに溶いて、8μlの4M NaCl, 40μl の13% PEG6000または8000で沈殿させる。（氷上20分、遠心4℃、20分）
１1）70% EtOHでwashし、TEまたは水に溶かし、吸光を測る。この場合やや多めの1 microgram相当をシーケンスする。理想的にはこの段階でゲルでpurityをチェックするのが望ましい。（RNAはほとんど見えませんでした)
#2 Qiagen精製のplasmidは、PEG沈無しで読むことができます
*最終的な収量はpGEX-LTB12DH(6000bp、一応high copyですが通常pBluescriptの半分くらいしかとれない)の場合、LB 10mlから5-20 μg(平均15μg), TB 10mlから40-120 μg(平均60μg)でした。pBluescriptではもう少しいいと思います。pGEX場合、templateとして0.5-1 μg使いましたが、34cmのゲルで400 bpまでNが1個あるかないかでした。kit添付のtenplateは550bpまでNo Nです(!)。
＃3 Primer
PrimerはSequenaseに使う17mer程度のものではAnnealが悪いので、少し長く作ったPrimerを用いる。一般的に用いられるReverse, M-20, T3, T7, KS, SK(いずれもABI用に作成して読めることを確認済み)はコントロール(M-21)にあわせて、0.8μMに調整して5研の-20 ℃に入っています。自分で作成するときのTmの目安は、2x(A+T)+4x(G+C)で50-60℃（マニュアルでは40-60となっているが、低いと読めない）である。
＃4 Cycle sequence反応
Reaction mixture
FS premix 8 μl
Double strand DNA 0.25-0.5 μg
Primer 3.2 mole (0.8 μM を4 μl )
water x μl
-----------------------------------
Total 20 μl
Hot startは必要ないが、氷上でmixして、circularの温度が96℃に上昇してからHoldしてTubeを差し込んですぐにstartすること。室温からstartするとMiss annealを起こしてしまい、Backgroundが高くなります。なお、FSになってからは、Double strand DNA 0.25-0.5 μgをtemplateにします。
Perkin-ElmerのThermal cycler480では#12(96度30秒、50度15秒、60度4分を25cycle)で、Thermal cycler9600ではFile 8(96度10秒、50度5秒、60度4分を25cycle)で反応させれば自動的にPCRを行って4℃でkeepするように設定してあります。9600はoil freeでOK(micro tubeを使うこと）ですが、480はoilが必要です。
＃5 シーケンス反応後の精製
1. Tube あたり50 μl EtOH, 2 μl 3M NaoAcを1.5 ml tubeに分注しておく。
2. PCR productを全量移す。
3. On ice 10分。
4. 遠心20分、上清をのぞく。
5. 70 % EtOH 250 μl でwash(これは必要です)
6. ふたを空けて5分室温放置後、Loading bufferに溶かす。(24 wellの場合は4 micro L, 36 wellでは3 micro L)
Pelletは見えないことが多いので、注意してエタ沈すること。心配な人はCarrierとして1 mg/ml Glycogenを1 micro L入れてエタ沈すればpptが見えるので安心です。またPelletに色(Pinkのことが多い)が付いているときはバックが高くてまず読めませんから、再度エタ沈を行うこと。
＃6 ゲル板の調整
マニュアルでは6%であり、現在マリソル(販売 東洋紡)のPremix gelを使っている。長く読もうとするとき、ゲル板の調整は大変重要で、流し込んでから、最低2時間、気温の低いときは4時間位は放置しておいた方が望ましい。(アクリルアミドの重合が大切のようです)。
1 マリソルのPremix gelを室温に戻す。このときureaが析出しているようなら、しばらく放置する。（決して振ってはいけない。特に泡は要注意です。）
2 ゲル板を専用の洗剤でよく洗う。（傷をつけないように注意。ゲル板は1 set ６万円）
3 Isopro+ ケイドライでゲル板をよく磨く。
4 Plate checkを行い、OKなら組み立てる(マニュアル参照)。
5 マリソルのPremix gelにAPS stickを1本加え、静かに20回転倒混和する。このとき空気が入らないように注意する。
6 先を切り、流し込む。上にスペーサーを入れて、サランラップで覆う（乾燥防止）。
7 そのまま2-4時間以上放置する。
＃7 泳動
1 TBEを2l 作る。
2 ゲル板のテープを全て除き、ガラスの表面を専用の洗剤(ケイドライ)で洗う。ゲルの上端は蒸留水でリンスする。
3 Isopro+ ケイドライでゲル板をよく磨く。
4 Plate checkを行い、OKなら組み立てる(マニュアル参照)。Pre Run を10分間行う。
5 サンプルを95-100℃、2 min. denature後、急速冷却しon iceにする。
6 再度ウェルを洗う（極めて大切）。
7 サンプルをロードし、start. (マニュアル参照) 各種設定を行う。大体マニュアル通りだが、マリソルのPremix Gel を使うときは電力量を26-28W(マニュアルでは30W)にした方がよい。サンプルの数が多いときは、一つおきにdenature、Loadを行う。2時間位で見え始めるが、この段階で肉眼で（もちろんモニター上ですよ）ラダーが見えなければ失敗です。
マニュアルに書いていないTips
１）両端のレーンの一つ外側に4 μl のLoading bufferをのせるとSmilingを防ぐことができる。
２）泳動する内に、次第にBackgroundは低くなるので、最初の蛍光光度の設定は高め(青が950位)にしたほうが長く読めます。(PMT voltageの設定)
＃8 分析
分析はマニュアルを参考にしていただきたいのですが、注意点を一つ。Gel fileを保存したくなりますが、別の名前にするとシステムが動かなくなるので、絶対に行わないで下さい。どうしてもとっておきたい人は、自分のHard diskか、MOに入れること。原則として泳動の翌朝には必ず解析し、データは自分で管理すること。終えたら誰かが上書きすると考えて下さい。多数のシーケンス反応を統合する際は、ABIの専用ソフトである、Autoassemblerを使うと便利です。