25.混合プライマーを用いたPCR法（横溝岳彦）
１）はじめに あらかじめ塩基配列のわかっているものでは、PCR Primerの設計や、PCR の温度設定は比較的単純である。アミノ酸配列や他の種の塩基配列から塩基配列を推定してPrimerを設計し、PCRによってDNA fragmentを得ようとするとき、Primerの設計や、PCR条件はいくつかの試行錯誤を経なければならない。今回、部分アミノ酸配列から、PCRによってLTB4-12-hydroxy-dehydrogenaseのN末の塩基配列を得ることができたので簡単にまとめる。
２）目的 蛋白精製に成功し、ある程度（100 mg )程度の精製蛋白が得られれば、制限酵素処理によってある程度のアミノ酸配列を知ることができる。しかし、N末をのぞいては、全長に対して、そのPeptide fragmentがどこに位置しているかを知ることはできない。また、アミノ酸の塩基配列の決定は慣れた者が行っても 1 fragmentあたり30 残基が限界であり、我々が現在6研にあるPeptide sequencerを用いて自らsequenceした場合、1 fragmentあたり、20残基がいいところであろうと思われる。一つのアミノ酸残基に対して、それをコードするDNA配列は1-6種類もあり、全ての考えられるDNA配列は天文学的な数になる。Cloning や Nothern blottingのProbeとしてOligonucleotide Probeを設計することもできるが、Hybridizationの条件決めに苦労することも多く、また幸運にもPositiveなPlaqueやBandが得られても、シグナルは弱いことが多く、それが目的とする核酸配列をもっている保証はどこにもない。従って、最初から全長を狙うのではなく、PCRで増幅されやすい中程度の長さ(200-500 bp)のDNA Fragmentを得て、これをProbeにしてきつい条件でHybridizationを行えば、自信を持って先のステップに進むことができる。
3)具体的例 PCRの本には、Degenerative Primerの設計法として以下の点が書かれている。
1.できるだけDegeneratveでない領域（例えばMet の多い部分）を選んで全長20-26bpのPrimerを設計する。
2.一つのPrimerのDegenerativityは516倍以下とする。
3.Anealingの温度は37℃から段階的にあげていく。
筆者の持っていたアミノ酸配列は以下の通りだった。(実はもっとあるが、今回は関係ないので割愛)
N-Terminal
V R A K S W T L K K H F V G Y P T P S N F E L K
GTT CGT GCT AAA TCT TGG ACT TTA AAA AAA CAT TTT GTT GGT TAT CCT ACT CCT TCT AAT TTT GAA TTA AAA
GTC CGC GCC AAG TCC ACC TTG AAG AAG CAC TTC GTC GGC TAC CCC ACC CCC TCC AAC TTT GAA TTA AAA
GTA CGA GCA TCA ACA CTT GTA GGA CCA ACA CCA TCA TTC CTT
GTG CGG GCG TCG ACG CTC GTG GGG CCG ACG CCG TCG CTC
AGA AGT CTA AGT CTA
AGG AGC CTG AGC CTG
F-8
I Q Y H E H E H I T E G F E N M Y A A F M G Q L
ATT CAA TAT CAT GAA CAT GAA CAT ATT ACT GAA GGT TTT GAA AAT ATG TAT GCT GCT TTT ATG GGT CAA TTA
ATC CAG TAC CAC GAG CAC GAG CAC ATC ACC GAG GGC TTC GAG AAC TAC GCC GCC TTC GGC CAG TTG
ATA ATA ACA GGA GCA GCA GGA CTT
ACG GGG GCG GCG GGG CTC
CTA
CTG
F-19
E G D M M M G E Q V A R
GAA GGT GAT ATG ATG ATG GGT GAA CAA GTT GCT CGT
GAG GGC GAC GGC GAG CAG GTC GCC CGC
GGA GGA GTA GCA CGA
GGG GGG GTG GCG CGG
AGA
AGG
（N末5' 順方向）
5' ggCTCgAg(AgCT)gC(AgCT)AA(Ag)(TA)(gC)(AgCT)TggAC 3'(23bp, 512x)
（N末3' 逆方向）
5' ggggATCCgT(TC)TT(AgCT)A(gA)(TC)TC(gA)AA(gA)TT(AgCT)(gC)(AT)(gC)GG 3'(31bp, 4096x)
といったPrimerを合成し、Anealing 37℃、42℃、47℃、55℃といった条件でPCRを行ったが、低い温度ではバンドの数が多すぎ、高くなるとバンドがなくなるという状況であった。
そのため、文献検索を行い、最近cloningされたRenal dipeptidaseの論文(BBA 1163 (1993) 234-242)を参考にしてPrimerのデザインを考え直した。その論文でのコンセプトは
1.30-40 bp の長めのPrimerを合成
2.3' 側のミスマッチをなくし、さらに全体のDegenerasityを16倍以下に抑える
3.5' 側は当然もっとも可能性の高いと思われるCodonを用いて長めに合成し、MismatchはAnealing の温度を下げる(論文では50℃)ことで対応する
4.Primerの濃度は高めにする
5.当然、Sequenceして目的のバンドであることを確認するために、Primer間に、わかっているアミノ酸かDNAの配列がなければならない
以上にのっとり、N末とF19の間でPCRを行うことにし（当然得られるバンドの長さはわからない）、得られたバンドを全てT-VectorにLigationし、Transfection してSequenceすることで目的としたDNA fragmentを得た。用いたPrimerは以下の通り。
P-NB (N末順方向）
5'-gTgCgCgCCAAgTCCTggACCCTgAA(Ag)AA(Ag)CA(TC)TT(TC)gT-3' (38 bp, 16x)
P-8B (F8逆方向）
5'-TACATgTTCTCgAAgCCCTCggTgATgTg(TC)TC(Ag)Tg(TC)TC(Ag)Tg-3' (41 bp, 16x)
P-19B (F19逆方向）
5'-gCgggCCACCTg(Cg)TC(AgCT)CCCATCATCAT(Ag)TC-3' (30 bp, 16x)
P-NB-P-8B, P-NB-P-19Bの間でPrimer濃度 final 5 μM (通常の1 μMよりも濃いことに注意), Anealing 45 ℃で 50cycleのPCRを行って計4本のバンド(210, 220, 550, 750bp)を得た。5本分(250 μl)のPCR ProductをPhe/Chl、エタ沈後、Polynucleotidekinaseにて5' endのリン酸化を行い、そのまま2% Agaroseゲルから切り出してT-VectorにLigationした。Sequenceにより、そのうちの一本(220 bp)が狙っていたN-末、F-19間のFragmentであることが判明した。(Kinationに関しては、前もってPrimerをKinationしておけばPCR後に反応を行わなくてもよいとのこと）
4)T-VectorへのLigation (Current protocol 15.7.2.)
Taq-polymeraseの特徴として、PCRで増幅されたDNA fragmentの3' endにAが一個Overhangするという特徴を逆手にとって、3' endに一個TをOverhangさせたVectorにLigationするという技である。これまではKlenow fragment やT4-DNA polymeraseでBluntingしたのちにBlunt end ligationしていたが、これよりもLigationの効率はよい。PharmaciaからSure clone Ligation Kitとして売っているのはBlunt end ligation kitであり、これを用いて入らなかったFragmentがPromega pGEM-T vector Systems (A3600)で一発でLigationできた。あまり細かい条件設定は行っていないが、Manualに書いてあるvector:insert ratio よりもinsertの量を増やす(1:5位に)のがいいようである。(ただしこれはゲルからの回収が悪かったせいかもしれません)くれぐれもKinationを忘れないように