23.PCR・RT-PCR（尾藤晴彦・佐藤佐由里）
1. PCRとは
PCR (Polymerase Chain Reaction)とは、DNA Polymeraseの反応を連続的、連鎖的に実行することにより、1セットのprimerの間にはさまれるDNA断片を特異的に増幅する反応である。好熱菌Termophilus aquariusより単離された Taq DNA Polymerase が開発されたため、同一チューブ内で連続的に反応を行うことが可能となった。
2. thermal cycler
純正のPerkin - Elmer 社以外のものは、基本的にすべてゾロ品であるが、ほとんどの場合、PCR 反応自体にはあまり変わりがない。当教室では、Astec 社の thermal cycler を使用している。これの特徴は、第1世代の Perkin - Elmer 社製品に比べ、heat block の熱伝導効率が良いことが挙げられたが、現在では、性能面でPerkin - Elmer 社の第 3 世代製品に完全に立ち遅れている。しかし、きわめて微妙な PCR 反応を除いて、十分今でも実用に耐えうる。
使い方は、電源を入れた後の初期画面より program file を選択し、それをRUNするか、EDITするかを選択する。ﾌｧｲﾙはリピートされうるループを 3 画面分記憶可能である。従って、1 面目を1st cycle、2 面目を 2nd - ( last-1 ) cycles、3 面目をlast cycle に当てることが多い。
3. 標準的な PCR 条件
10 x PCR buffer : 100mM Tris (pH 8.3)
500mM KCl
15mM MgCl2
0.1% (W/V) Gelatin
10 x dNTP : 2mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP each
10 x primer 1 : 2.5μM - 10 μM
10 x primer 2 : 2.5μM - 10 μM
protocol ;
1.Mix as follows :
10 x PCR buffer 5μl
10 x dNTP 5μl
10 x primer 1 5μl (final 20-100pmol)
10 x primer 2 5μl (final 20-100pmol)
DNA template 1μl
DDW 29μl
------------------------------------
total vol. 50 μl
2 . PCR cycles
1st cycle ( hot start )
denature at 94℃, 5min ,
hold at 80℃,
add 0.2-0.5μl Taq Polymerase ( 1 - 2.5 units )
anneal at xx ℃, 2min, ( xxは45 - 65の間 ）
elongate at 72℃, 3min.
2nd cycles
denature at 94℃, 1min
anneal at xx ℃, 2min
elongate at 72℃, 3min.
Last cycle
denature at 94℃, 1min
anneal at xx ℃, 2min
elongate at 72℃, 10min.
3.check PCR by electrophoresis
4. PCR の条件検討
a ) サイクル数
ゲノム1μgを template とした場合、32 cycles でバンドが検出できるはずである。また、いわゆる RTー PCR（後述）の場合も、通常は 40 cycles 以下で検出されるものがほとんどである。それ以上のサイクル数が求められるのは、primer の annealing が悪い（ annealing 温度が高すぎる。primer に不純物が混入している。primerの特異性が悪い。）ためと考えられ、サイクル数を増やしても、nonspecific band が増えてしまうことが多い。
b ）annealing 温度
高いほど PCR 反応の特異性は理論的には向上する。しかし、Tm= 4 x (G+C) + 2 x (A+T)を超えると1サイクル当たりに anneal する primer の確率が減少してくるので、逆に産物量が減る。一般に specific primerであれば、20 mer の場合、55℃から反応条件を検討し、徐々に上げて最適温度を決めるのが妥当である。また、一般的には、（Tm-5) ℃位から徐々に温度を上げていくのが良いとされている。なお、TOYOBO の10 x buffer を使用する場合、triton X - 100 が入っているので、annealing 温度は約10℃低 く設定が可能で、background が低くきれいな band が得られる。
c ）elongation 時間
一般にPCR fragment size 1kb 当たり1min が標準的な伸長速度といわれているので、目的の size に応じて elongation 時間を調節する。
d ）Mg2+ 濃度
final 0.5 mM から5 mM の間で検討の余地があり、0.5 mM 毎に検討しておくのが理想的である。一般的には、Mg2+ 濃度が高すぎると二本鎖DNAの変性が起こりにくくなり、また、Taq Polymerase は 10mM MgCl2 によって 40 - 50 ％ の阻害を受けるので MgCl2 を過剰に加えるのは良くない。一方、dNTP は Mg2+ と結合しうるので、正確な Mg2+ 濃度は dNTP 濃度によっても決まる。有効なMg2+ 濃度は dNTP の total の濃度よりさらに 0.5 - 2.5mM 高めに設定する。また、試料 DNA が Tris、EDTAなどに溶けている場合は、Mgイオンがキレートされることがあり、EDTAの濃度分だけMg2+ 濃度を高くすることが必要である。というのは、Mg2+ 濃度は低すぎても PCR fragment の productivity が低下するためである。
e ) dNTP 濃度
Polymerase 反応は平衡反応であるから、dNTP が過剰量ないと反応が進まない。しかし、Taq Polymeraseは proof reading な 3' - 5' exonuclease 活性が欠如しているので、dNTP が濃すぎたり、また、4 種の濃度を均 一にしないと misincorporation rate が増大する。subcloning 目的では、PCR条件が決まったあとでなら、 final 20μM で 32 cycles 位試みるのが良いかもしれない。
ｆ）detergent
Tween20, NP40, DMSOを添加するとある種の primer で PCR がよりよく反応することが知られている。また、低濃度の SDS による Taq Polymerase 活性の阻害効果は、高い濃度の detergent を加えることで帳消しにすることできる。たとえば、0.01 % SDS の阻害効果は、0.5 % Tween20 or NP40 でなくなる。
g ) Taq Polymerase
特許の関係上、PCR 反応を行うためには、最低1回は Perkin - Elmer 社の GeneAmp kit を使用する義務がある。一方、Taq Polymerase 自体は特許の対象ではないので、酵素として各社が販売しているが、PCR に使えるのは、Ampli Taq DNA Polymerase ( Takara ) のみである。Taq Polymerase 以外の耐熱菌由来酵素としては、TOYOBOの Taq DNA Polymerase , Stratagene の Pfu Polymerase, New England Biolabs の Vent Polymerase などがある。当教室では、TOYOBO の Taq DNA Polymerase を使用している。
5.PCRの応用
それ自体でこの項は何冊もの本になるので可能性のみ列挙する。
1）Point mutation の検出
2) mRNA の検出、定量
3) degenerate primers による cloning ( peptide sequence より）
4) homologous gene cloning ( gene family, cloning across species )
5) detection of infectious pathogens ( virus, bacteria )
6) DNA診断（ 法医 ）
7) site - directed mutagenesis
8) direct sequencing of plasmid and genome
6.PCR断片のsubcloning : T-vector の利用
The protocol as follows can be adapted for any vectors, either for expression, sequencing or multiple purposes. However, our experience so far is restricted to the use of pBluescript SK-( Straragene ) as base vector.
1) T-end vector preparation: The vector DNA must be cleaved beforehand by a blunt-end cutter such as Hinc II, EcoRV or Sma I , and purified by gel excision.
blunt-end vector 5μg
10 x PCR buffer 5μl
100mM dTTP 2μl ( final 4mM )
MilliQ water xμl
Taq Polymerase 5 units
total vol. 50μl
reaction at 70℃, for 2 hrs.
reaction ended by phenol/chloroform extraction
ppt dissolved in MilliQ water.
check concentration by electrophoresis and dilute solution in approximately 50-100 ng/μl.
2) ligation for PCR cloning
2-a ; insert preparation
PCR fragment must be purified by gel excision to remove excess PCR promers, free nucleotides,
and nonspecific products.Resuspend PCR fragment in a final 100 ng/μl concentration in MilliQ
water.
2-b ; ligation reaction
insert DNA 3μl
vector DNA 0.5μl
10 x PCR buffer 0.5μl
10mM ATP 0.25μl
DDW 0.25μl
T4 DNA ligase 0.5μl
-------------------------------------------------
total vol. 5μl
reaction at 4℃, overnight.
transformation into JM-109, XL1-blue.
spread on a LB/ampicillin plate with X-gal / IPTG to carry out blue / white selection.
This protocol has been optimized to yield >50% white colonies.
7. RT-PCR ( Reverse-Transcriptase PCR )
Material ;
MMLV reverse transcriptase : BRL
5 x RT buffer : 上記に添付
10 x DTT : 上記に添付
dNTP mixture : 2mM dATP, dCTP, dGTP, d TTP each
dN6 (random 6-mer ) : Pharmacia, 200ng/ml
or oligo(dT)12-18 : Pharmacia, 200ng/ml
Method ;
1. prepare RNA sample ( total RNA 1 - 50μg or poly A+ RNA 1μg )
2. Heat denature at 65℃ for 10 min and chill quickly on ice-water
3. Mix as follows :
5 x buffer : 4μl
10 x DTT : 2μl
2mM dNTP : 5μl
dN6 or oligo(dT) : 1μl
RNA sample : 7 μl
RT : 1μl
----------------------------------------
total vol. 20μl
4. incubate at 37℃ for 60min.
5. take 1μl as template for PCR. Usually, 40 cycles is sufficient even from samples starting
from 1 μg total RNA.
a ) 第一鎖の cDNA を合成する際、多くはどの priming 法をとっても結果はほぼ同じであるが、３'側の primer を使用した場合、5 - 100 pmol で十分と思われる。過剰な primer は一般に無関係な DNA の増幅を引き起こし、最終的に PCR 生成物が均一でなくなるおそれがある。実際には５pmol 程度の primer で特異的DNA の増幅は可能である。たとえば、oligo ( dT ) を用いた場合、0.1 - 0.2 μg が至適条件である。 dN6を用いると最も効率がよく最終生産物の DNA 量の増大が期待できる。
b ) Pharmacia の " First - Strand cDNA Synthesis Kit " もある。これは、Reaction MixesにM-MuLV, RAA guard, RNase / DNase free BSA, dNTPs が入っており、その他、同 Kit 中のDTT solution, pd(N)6, or Not I - d ( T )18, RNase - Free waterを加えると1st - Strand - DNAが合成できる。ただし、incubateの時間は上記のMethod と同じである。