21.Primer Extension（加藤和彦）
mRNAの転写開始点を決定したり、転写活性の定量を行うために用いられる。遺伝子内に由来するプローブをRIで標識し相補的RNAとハイブリダイズさせた後、逆転写酵素で伸長させる。
- プライマー（合成オリゴヌクレオチド）の５’末端標識
プライマーは合成オリゴヌクレオチド（２０～３０mer）を用いることがほとんどである。二本鎖DNAを用いることもできるが、DNA-DNAリアニーリングの問題がありハイブリダイゼーションの条件設定が難しいようである。
primer 1～50 pmol
［γ-32P］ATP (3000Ci/mmol) 0.37～3.7 Bq
T4 polynucleotide kinase 5～20 U
10×buffer (500mM Tris-HCL(pH8.0), 100mM MgCl2, 50mM DTT)
Total 20～100μl
37℃ 30min
70℃ 5～10min（酵素失活）
反応終了後、エタノール沈殿しTE buffer or DWで沈殿を溶解する。一部をとり、チェレンコフ光を測定し5×105cpm位（条件検討を行い、できるだけ少量）を用いる。
- ハイブリダイゼーション
RNAはtotal RNAよりもpoly(A)+RNAを用いたほうが、感度が高くきれいな結果が得られるようである。また、用いるmRNA, primerの量、ハイブリの温度、時間等は条件検討をおこなう必要がある。
Tris-HCl(pH8.3) 10mM
EDTA 1mM
KCl 0.25M
primer 5×105cpm位
mRNA 数μg
40～60℃、数時間アニーリングさせる。
- 逆転写反応
アニーリングしたものを希釈して以下のようにする。
KCl 75mM
MgCl2 10mM
Tris-HCl(pH8.3) 20mM
DTT 10mM
4dNTPs 各0.25mM
reverse transcriptase 100unit/ml
あるいはアニーリング後、一度エタ沈し逆転写酵素に添付のbufferで溶解する。そしてdNTPと酵素を加える。
42℃ 1h （伸長反応は mRNA 内の二次構造形成を抑えるため42℃でおこなう）
エタ沈、ホルムアミド色素溶液（90% formamide, 5mM EDTA, 0.05% BPB, 0.05% XC)で溶解する。
- 電気泳動
６％ポリアクリルアミドゲル（一般的なシークエンス用のゲル）で泳動する。この時、伸長産物のレーンの隣に同じプライマーを用いて行ったシークエンスのサンプルも同時に泳動しておき、泳動後バンドを比較し解析をおこなう。