19.cDNAライブラリー作成法（中村元直、横溝岳彦）
（横溝注）これは大変良くできたマニュアルなので、いくつか（横溝注）という形でコメントするにとどめました。現在改良点も多いので15.1も参考にして下さい。
１．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌＲＮＡ
（モルモット白血球の調製）
(用意するもの)
･ﾓﾙﾓｯﾄ:ﾊｰﾄﾚｰ系､ﾒｽ､350g ･2%ｶｾﾞｲﾝ溶液 ･生理食塩水
1.前日から絶食させたﾓﾙﾓｯﾄの腹空内に体重の1/10容の2%ｶｾﾞｲﾝを注入する｡
(50mlｼﾘﾝｼﾞ及び18G針を使用)
2.約18時間後､腹空内から好中球を回収｡腹空内を生理食塩水で洗浄することで回収率を高める｡
3.ｶﾞｰｾﾞで濾過してｺﾞﾐを除く｡
4.500xg,3分間､遠心する(500ml遠心ﾁｭｰﾌﾞ)｡
5.沈澱を10倍容の滅菌水に懸濁し赤血球を壊した後､即等量の(x2)生理食塩水を加える｡
6.50mlﾌｧﾙｺﾝﾁｭｰﾌﾞに移す｡
7.500xg､3分間､遠心する｡
8.-70oCで保存する｡(ﾁｭ-ﾌﾞのまま保存)
*2~5x108Cells/ﾓﾙﾓｯﾄの好中球が期待できる｡
この場合Wet Weighで約0.2g/ﾓﾙﾓｯﾄ程度となる｡
（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調整）
(用意するもの)
･GTsoln
ｸﾞｱﾆｼﾞｳﾑﾁｵｼｱﾈｰﾄ 120g
ｻﾙｺｼﾙ 1g
EDTA 0.372g
(1M)ｸｴﾝ酸ﾅﾄﾘｳﾑ(pH7.0) 5ml
200ml
（横溝注）このステップは現在kitとしてPharmaciaから市販されている。（15.1参考）
1.1g好中球/30mlGTsoln.の濃度になるようにGTsoln.を加え､120μの2MEを加えた後よく懸濁して細胞を破砕する｡
2.50ml用超遠心ﾁｭｰﾌﾞ(DEPC処理)にCsCl溶液を8ml入れ､さらにこの上に細胞を破砕したGTsoln.を重層する｡
3.26,0000rpm､15oC､50時間以上遠心する｡Rotor:SRP28SA
4.遠心後､GTsoln.及びCsCl溶液部分をｱｽﾋﾟﾚｰｼｮﾝで除く｡この場合RNAはﾁｭｰﾌﾞの底に沈澱しているのでｱｽﾋﾟﾚｰｼｮﾝでCsCl溶液部分を除く際には少し液を残すつもりにする｡
5.新しいGTsoln.(2,3ml程度)でﾁｭｰﾌﾞの壁面を洗い､今度はできる限り完全にｱｽﾋﾟﾚｰｼｮﾝで液を除く｡
6.沈澱物(RNA)を素早く80%ｴﾀﾉｰﾙでﾘﾝｽし､ﾁｭｰﾌﾞを伏せて液をきる｡(2,3分間)
7.ﾁｭｰﾌﾞの底の沈澱物を1mlのTESに溶かし(ﾋﾟﾍﾟｯﾄﾏﾝを使ってもよい) 同時に1mlのﾌｪﾉｰﾙ(TE飽和)を加えて十分混合する｡
8.この溶液(2ml)をｺﾚｯｸｽｶﾞﾗｽﾁｭｰﾌﾞ(ｼﾘｺﾝ処理)に移し､1mlのｸﾛﾛﾎﾙﾑを加えてさらに十分に混合する｡
9.ﾊﾟﾗﾌｨﾙﾑでﾁｭｰﾌﾞにふたをし､10,000rpm､15oC､10分間遠心する｡
10.上層を別のｺﾚｯｸｽﾁｭｰﾌﾞに移し､下層に1mlの滅菌水を入れてさらによく混合する(ﾊﾞｯｸ抽出)｡
11.10,000rpm､15oC､10分間遠心後､上層を先の上層と合わせる(ﾄｰﾀﾙ2ml)｡
12.200μlの(3M)NaoAc､4.5mlのｴﾀﾉｰﾙを加え､ー70oC､2時間放置後､ー20oC､2時間放置する｡
13.10,000rpm､4oC､10分間遠心する｡
14.沈澱物(大部分がRNA)を1mlの滅菌水(DEPC処理)に溶かす｡
15.500μlずつｴｯﾍﾟﾝﾁｭｰﾌﾞに分け､ｴﾀﾉｰﾙ沈澱の状態でー70oCに保存する｡
*これで約3mgRNA/10匹ﾓﾙﾓｯﾄのTotal RNAが得られる｡
長期保存の場合にはｴﾀﾉｰﾙ沈澱の状態でー70oCにいれておくのがよい｡
(RNAの定量)
OD260の値を測定する｡この値が1.0の時､RNA濃度は40μg/mlとなる｡またOD280の値も測定しOD260/OD280=2.0に近い程RNAの純度が高いと予想される｡またｱｶﾞﾛ-ｽｹﾞﾙ電気泳動でもﾁｪｯｸする必要あり｡この場合28SrRNAと18SrRNAのﾊﾞﾝﾄﾞがはっきり確認でき、しかもそも比が2:1ならば完璧に成功です。
２．Ｐｏｌｙ（Ａ＋）ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
(用意するもの)
･Oligotex-dT30 (super)(第一化学薬品)
･5M NaCl(DEPC)
1.ｴｯﾍﾟﾝﾁｭ-ﾌﾞ(1.5ml)に500μgのRNA(250μl)を用意する｡
2.250μlの(x2)elutionﾊﾞｯﾌｧ-を加える｡
3.500μlのOligotex-dT30を加え､よくﾐｯｸｽする｡
4.65oC､5分間ｲﾝｷｭﾍﾞ-ﾄする｡
5.氷中で急冷する｡
6.100μlの(5M)NaClを加え､十分混ぜる｡
7.37oC､10分間ｲﾝｷｭﾍﾞ-ﾄする｡
8.14,000rpm､5分間遠心する｡
*新製品の樹脂(Super)は短い遠心時間でしっかりとした
ﾍﾟﾚｯﾄになってくれる｡もし遠心不十分のようならばさらに5分間遠心するとよい｡
9.上清を除く(ﾋﾟﾍﾟｯﾄﾏﾝを使う方がよい)｡
10.沈澱した樹脂を400μlの滅菌水(DEPC)に懸濁する｡
11.65oC､5分間ｲﾝｷｭﾍﾞ-ﾄする｡
12.14,000rpm､5分間遠心する｡
*この場合も遠心不十分のようならばさらに5分間遠心する｡
13.上清を別のｴｯﾍﾟﾝﾁｭ-ﾌﾞに移す｡
14.20μl(1/20vol)の(5M)NaCl(DEPC)を加え､
さらに1mlのｴﾀﾉ-ﾙを加えて良く混ぜる｡
15.-70oC､2時間以上放置する｡この状態で保存可能｡
３．Size fractionation of poly(A+) RNA by sucrose density gradient
(用意するもの)
･密度勾配調製器(図1にある器具､5研にある)
･5%および30%ｼｮ糖溶液(下記)
1.図１に示すように、６ｍｌの５％ショ糖溶液と５．５ｍｌの３０％ショ糖溶液を用いてショ糖溶液の密度勾配を作る。
･5%ｼｮ糖溶液 30%ｼｮ糖溶液
Sucrose 5% 30%
Tris-HCl(pH7.5) 10 mM 10 mM
EDTA 1 mM 1 mM
SDS 0.1% 0.1%
2.約200μgのpoly(A+)RNA(100~300μl)に1/10容の10%SDSを加える｡
3.65oC､5分間､ｲﾝｷｭﾍﾞ-ﾄしRNAをほぐす｡
4.室温に戻した後､ｼｮ糖密度勾配溶液の上に重層する｡
(氷中で急冷するとSDSが析出してしまうので注意)
5.24,000rpm､15oC､18時間､超遠心する(rotor:RPS40T)
6. 図2に示した装置を組立て､ﾍﾟﾘｽﾀﾎﾟﾝﾌﾟの流速を0.5ml/minとなるように調節する｡
*図2の装置に必要なもの(すべてRNase freeにする)
･ｼﾘｺﾝ処理ｷｬﾋﾟﾗﾘｰ(長､短､各々1本ずつ)
･ｼﾘｺﾝ処理ｴｯﾍﾟﾝﾁｭｰﾌﾞ､約30本
7.遠心後のﾁｭｰﾌﾞを回収装置に固定し(図2)長いｷｬﾋﾟﾗﾘｰを静かにﾁｭｰﾌﾞの底まで降ろす｡
8.ﾍﾟﾘｽﾀﾎﾟﾝﾌﾟのｽｨｯﾁをONにし､ｴｯﾍﾟﾝﾁｭｰﾌﾞに0.5mlずつ回収する｡このときｴｯﾍﾟﾝﾁｭｰﾌﾞ内に先に50ulの(3M)NaoAc(DEPC処理)を入れておくと回収後即ｴﾀ沈できる｡約25~30本のﾁｭｰﾌﾞに回収後1mlのｴﾀﾉｰﾙを入れてー70oCに2時間以上保存する｡
9.cDNA合成あるいはoocyteへのｲﾝｼﾞｪｸｼｮﾝに用いる場合､SDSを完全に除くためにｴﾀ沈は2回以上したほうが良い｡
（横溝注）現在cDNA合成後にSize fractionationを行うことも多い。hybriのためのライブラリならこの段階でのsize cutは不要と思われます。
4. Synthesis of cDNA libraly
(用意するもの)
･Pharmacia社製cDNA合成Kit
･5ml ｶﾞﾗｽﾋﾟﾍﾟｯﾄ 2本 (ｼﾘｺﾝ処理が必要)
･Sepharose CLー4B (Pharmacia)
･Sephacryl Sー1000 (Pharmacia)
（横溝注）現在RTはMMLVでなくSuperscript(BRL)を使うことが多い。（15.1参照）
1.3~5μgのpoly(A+)RNAを用意する｡これに滅菌水(DEPC処理)を加えて20μlとする｡
2.65oC､10分間ｲﾝｷｭﾍﾞｰﾄ後､氷中で急冷する｡
3.このRNA溶液を1st strand合成溶液(kit)内に入れ､更にDＴT溶液を1μl,[αー32P]dCTPを1μ加える｡
4.37oC､1時間反応する｡
5.1st strand合成溶液を2ndstrand合成溶液(kit)内に入れ､更に[αー32P]dCTPを5μl加える｡
6.12oC､1時間反応後､22oC､1時間反応する｡
7.1μlのklenowﾌﾗｸﾞﾒﾝﾄ(kit)を加え､37oC､30分間ｲﾝｷｭﾍﾞｰﾄする｡
8.Phe/Chlo抽出で除蛋白をし､ｹﾞﾙ濾過で合成されたcDNAをfreeの小分子物質と分離する(図1参照)｡
*平衡化ﾊﾞｯﾌｧｰはTE(1mM:0.1mM)
*流速は100μl(2滴)/min.とし､100μlずつｴｯﾍﾟﾝﾁｭｰﾌﾞにｻﾝﾌﾟﾘﾝｸﾞしていくとNo.17~20付近のﾌﾗｸｼｮﾝからcDNAが回収される｡No.40ぐらいまでｻﾝﾌﾟﾘﾝｸﾞすればよい｡
9.液体ｼﾝﾁﾚｰｼｮﾝｶｳﾝﾀｰで各ﾌﾗｸｼｮﾝのｶｳﾝﾄを測定しcDNAを含むと思われるﾌﾗｸｼｮﾝを1本のﾁｭｰﾌﾞ(ｼﾘｺﾝ処理)に集める｡
*ﾋﾟ-ｸは2つ見られるが最初の小さい方がcDNAのﾋﾟ-ｸ｡
10.これを凍結乾燥する｡overnight!
*1日目終了
11.凍結乾燥させたcDNAを90μlの滅菌水に溶かす｡
12.10μlの(3M)NaoAcと200μlのｴﾀﾉｰﾙを加えー70oC､2時間放置する｡
13.1,4000rpm､10分間遠心する｡
14.沈澱物を44μlの滅菌水に溶解後､5μlのbluntingkit(x10)ﾊﾞｯﾌｧｰと1μlのT4DNAﾎﾟﾘﾒﾗｰｾﾞを加え､37oC､15分間ｲﾝｷｭﾍﾞｰﾄする｡
15.Phe/Chlo抽出後､上層(水層)に5μlの(3M)NaoAc､110μlのｴﾀﾉｰﾙを加えー70oC､2時間放置する｡
16.14,000rpm､10分間遠心する｡
17.沈澱物を40μlの滅菌水に溶解する｡
18.EcoRIｱﾀﾞﾌﾟﾀｰﾗｲｹﾞｰｼｮﾝを行う｡･ATPはpHに注意!Pharmacia社製の溶液が良い
(反応組成)
cDNA溶液 40μl
EcoRIｱﾀﾞﾌﾟﾀｰ 1.5μl
x10)ﾊﾞｯﾌｧｰ 5μl
25mM ATP 1μl
T4DNAﾘｶﾞｰｾﾞ 2.5μl
50μl
12oC､overnight
*2日目終了
19.ﾗｲｹﾞｰｼｮﾝ反応液を65oC､10分間熱処理する｡(T4ﾘｶﾞｰｾﾞの失活)
20.氷中で急冷後､4μlの25mMATP､1μlのT4ﾎﾟﾘﾇｸﾚｵｷﾅｰｾﾞを加え､37oC､30分間ｲﾝｷｭﾍﾞｰﾄする｡
21.Phe/Chlo抽出後､ｹﾞﾙ濾過(Sepharose CLー4B)でﾌﾘｰのｱﾀﾞﾌﾟﾀｰを除く｡
*ｶﾗﾑは図1と同じものでよい｡
*平衡化ﾊﾞｯﾌｧｰ､流速ともに図1と同じ｡
*100μlずつｻﾝﾌﾟﾘﾝｸﾞするとNo.17~22付近でcDNAが回収できる｡
22.cDNAを含むﾌﾗｸｼｮﾝを1本のﾁｭｰﾌﾞ(ｼﾘｺﾝ処理)に集め凍結乾燥する｡
*3日目終了
23.凍結乾燥したcDNAをTENﾊﾞｯﾌｧｰ(1mM:0.1mM:100mM)に溶かし､再度ｹﾞﾙ濾過する｡
*樹脂はSephacryl S-1000｡
(これにより短いcDNAを除くことができる)
*平衡化ﾊﾞｯﾌｧｰはTEN｡
*その他は図1と同じ｡40本程度ｻﾝﾌﾟﾘﾝｸﾞする必要あり｡
24.No.18から40までの偶数番号のﾁｭｰﾌﾞから5μl程度ｻﾝﾌﾟﾘﾝｸﾞしｱｶﾞﾛｰｽｹﾞﾙ(ﾐｭｰﾋﾟｯﾄｹﾞﾙ)で電気泳動する｡残りのｻﾝﾌﾟﾙはー20oCに保存しておく｡
25.ｱｶﾞﾛｰｽｹﾞﾙをﾄﾞﾗｲし(ｼｰｸｪﾝｽ用)､ｵｰﾄﾗﾌｨﾙﾑをはさんでー70oCでovernight置く｡
*4日目終了
26.ｵｰﾄﾗﾌｨﾙﾑを現像し､各ﾌﾗｸｼｮﾝのcDNAの長さを比較する｡
27.目的とする長さのcDNAのﾌﾗｸｼｮﾝを溶かし､1本のﾁｭｰﾌﾞ(ｼﾘｺﾝ処理)に集め､凍結乾燥する｡
（横溝注）凍結乾燥は収率が悪いため現在あまり行われない。エタ沈を行うことが多い。
*5日目終了
28.凍結乾燥したcDNAを45μlの滅菌水に溶かし､5μlの(3M)NaoAc､100μlのｴﾀﾉｰﾙを加えてー70oC､2時間放置する｡
（横溝注）ここではNa塩ではなく、NH4OAcの方が次のライゲーションでの失敗が少ない。
29.14,000rpm､10分間遠心する｡
30.沈澱物を20μlの滅菌水に溶かす｡
31.LambdaZAPIIﾍﾞｸﾀｰとのﾗｲｹﾞｰｼｮﾝ
(反応組成)
cDNA 2.5μl
λZAPII 0.5μl
(x10)ﾊﾞｯﾌｧｰ 0.5μl
5mM ATP 1.0μl
T4ﾘｶﾞｰｾﾞ 0.5μl
5.0μl
4oC､overnight
*6日目終了
32.反応液の半分(2.5μl)をﾊﾟｯｹｰｼﾞﾝｸﾞ｡残りは-20oCで保存｡ﾊﾟｯｹ-ｼﾞﾝｸﾞはまず2.5μlの反応液を赤色のﾁｭ-ﾌﾞに入れ､更に黄色のﾁｭ-ﾌﾞの液を15μl取り､これに加えて十分ﾐｯｸｽする｡この際泡立てないようにする｡
33.22oC､2時間ｲﾝｷｭﾍﾞ-ﾄする｡
34.500μlのSMﾊﾞｯﾌｧ-と50μlのｸﾛﾛﾎﾙﾑを加える｡
35.十分にﾐｯｸｽし､4oCで保存する｡
（横溝注）現在Packagingは一本のチューブで行えるようになった。(Stratagene, Gigapack III)
(TiterCheck)
36.Host cell(E.coli XL1-Blue,OD600=0.5,10mM MgCl2に懸濁)を用意する｡
37.上述のﾗｲﾌﾞﾗﾘ-(500μl)の一部を100倍希釈したものを用意する｡
38.300μlのHost cellと10μlのﾗｲﾌﾞﾗﾘ-希釈液をﾐｯｸｽし､37oC､15分間ｲﾝｷｭﾍﾞ-ﾄする｡
*反応には5mlﾌｧﾙｺﾝﾁｭ-ﾌﾞを使うと便利!
*ﾗｲﾌﾞﾗﾘ-希釈液の種類を数種用意しておけばより正確なtiterが求められる｡
39.NZY top agarを3ml加え､NZY plate(9cm,丸型)に蒔く｡
40.37oC､8時間ｲﾝｷｭﾍﾞ-ﾄする｡
41.ﾌﾟﾗ-ｸの数を計算する｡（Expression cloning の場合100万pfu/μg arm 以上が望ましい）
もし､100個のﾌﾟﾗ-ｸが出ていたらtiterは以下の式で計算される｡
100x100(希釈率)x50(全ﾗｲﾌﾞﾗﾘ-中の数に勘算)
x2(ﾗｲｹﾞ-ｼｮﾝﾐｯｸｽ全量に勘算)
x2(λZAPII 1μgを用いた場合に勘算)
=200万pfu/μg armとなる｡
（横溝注）同時にX-galとIPTGを用いて、color selectionを行うこと。(Top agarに、final 5mM IPTG, 30mM X-galを加えておけばいい）これにより、insertの入ったクローンの割合（5%位なら成功)を知ることができる。この段階で10-20個のwhiteのクローンをランダムに選び、insertの長さを確認する。
５．Preparation of Xenopus laevies oocytes
(用意するもの)
･ｱﾌﾘｶﾂﾒｶﾞｴﾙは浜松生物教材株式会社(Tel:05359-2-7822)り購入｡国産は一匹､1000円｡ｱﾌﾘｶ産は一匹､2200円｡購入した直後は餌を食べないこともある｡1~2週間すれば環境になじんで餌も十分食べるようになるのでそれまでoocytesは使わないほうがよい｡
･MBS溶液(CaCl2を入れたものと､入れていないもの）
1.ｶｴﾙを氷中につける｡約30分間すればｶｴﾙは冬眠状態になる｡
2.ｶｴﾙの下腹部を5mm程度ﾊｻﾐで切り､ﾋﾟﾝｾｯﾄで卵母細胞を取り出す｡取り出した卵母細胞はMBS(Ca2+free)の入ったｼｬ-ﾚにいれる｡
ｶｴﾙの傷口は外科用ｱﾛﾝｱﾙﾌｧでふさいでやる｡十分接着するまで(1時間程度)ｶｴﾙは氷上で眠らせておく｡
*傷をふさいだｶｴﾙは一週間程度他のｶｴﾙとは別に飼育してやる方がよい｡
3.ﾋﾟﾝｾｯﾄで卵の房を裂く｡慣れるまでは顕微鏡下で行う方が良い｡
4.0.2%ｺﾗｹﾞﾅ-ｾﾞ(Sigma､typeII)入りMBS(Ca2+free)内で約2時間､室温でｲﾝｷｭﾍﾞ-ﾄする｡
*ｺﾗｹﾞﾅ-ｾﾞはLot.ﾁｪｯｸの必要あり｡
*1.5時間を過ぎた頃から反応の進み具合をﾁｪｯｸした方がよい｡ﾋﾟﾝｾｯﾄで房を摘んでみて房が少し裂けてしまう程度で反応を止める｡
5.卵母細胞を新しいMBSで洗ってやることで反応を止める｡
*ここから先のMBSにはすべてCa2+が含まれる｡ｺﾗｹﾞﾅ-ｾﾞ反応中､Ca2+freeにすることで卵母細胞に悪影響を及ぼす未知の活性を抑える｡
6.顕微鏡下､卵母細胞表面の膜をﾋﾟﾝｾｯﾄで除く｡
*これがうまくできるようになるにはかなり経験が必要!頑張ってください!!
7.膜をのぞけば即ﾏｲｸﾛｲﾝｼﾞｪｸｼｮﾝできるが､初心者の方はMBS中で一晩放置し生き残ったものだけ用いるようにしたほうがよい｡
６．Preparation of lambda phage DNA
(用意するもの)
･SMﾊﾞｯﾌｧｰ
NaCl 5.8g
MgCl2 2.0g
ｾﾞﾗﾁﾝ 0.1g
1MTris(pH7.5) 50ml
up to 1,000ml
･PEGsoln.
PEG6,000 100g
NaCl 58g
SM up to 500ml
1.前日､角ﾌﾟﾚ-ﾄ(15cmx9cm)にﾌｧ-ｼﾞをまく｡(Titer=5万)
2.O/N(約10時間)培養,at37oC
3.全面溶菌を確認後､SMﾊﾞｯﾌｧ-を12ml入れて室温で1.5時間振とうする｡
4.50ml遠心ﾁｭ-ﾌﾞにSMﾊﾞｯﾌｧ-を回収し､更にﾌﾟﾚ-ﾄ表面を4mlのSMﾊﾞｯﾌｧ-でWash後これも同じﾁｭ-ﾌﾞに回収する｡
5.ﾁｭ-ﾌﾞを10,000xg､10分間遠心し上清を別の50mlﾁｭ-ﾌﾞへ移す｡
6.RNase(10μg),DNase(10μg)を加え､37oC､10分間ｲﾝｷｭﾍﾞ-ﾄする｡
7.15mlのPEGsoln.を加え充分混合後､氷中に2時間放置する｡
8.ﾁｭ-ﾌﾞを10,000xg､10分間遠心後､上清を捨てﾁｭ-ﾌﾞを伏せて充分PEGsoln.を除く｡(この場合､ｷﾑﾜｲﾌﾟを使って除いても良い)
9.沈澱物を1mlのSMﾊﾞｯﾌｧ-に溶かし(完全に溶かすことが重要)､これを1.5mlﾁｭ-ﾌﾞへ移す｡
10.10,000xg､2oC､10分間遠心する｡この時ｱｶﾞﾛ-ｽが沈澱物として除かれる｡
11.上清を15mlP.P.ﾁｭ-ﾌﾞへ移し､RNase(2μg)を加えて室温で
10分間放置する｡
12.50μlEDTA (0.5M),30μlSDS(10%)を加えて65oC､25分間ｲﾝｷｭﾍﾞ-ﾄする｡
13.1mlのPhe./Chlo.を加えﾎﾞﾙﾃｯｸｽで充分混合する｡
14.3,000xg､室温､10分間遠心する｡
15.上層を1.5mlﾁｭ-ﾌﾞ2本に分ける｡(約500μl/ﾁｭ-ﾌﾞ)
16.50μlNaoAc(3M)､1mlｴﾀﾉ-ﾙを加え充分混合後､-70oC､10分間放置する｡
17.1,2000xg､2oC､10分間遠心後､上清を完全に除き各ﾁｭ-ﾌﾞの沈澱物を100μlのTEsoln.に溶かす｡
18.(15.)で2本に分けたｻﾝﾌﾟﾙを1本に集める｡(計200μl)
19.200μlPhe./Chlo.を加え充分混合後､10,000xg､室温､5分間遠心する･
20.上層を別のﾁｭ-ﾌﾞへ移し100μlNH4oAc,600μlｴﾀﾉ-ﾙを加えて-70oC､15分間放置する｡
この時点で1日目の実験を終了しても良い
*この時点で糸状のDNAが見えれば実験は成功!もしﾂﾌﾞﾂﾌﾞの析出物が多く見られればRNAが大量に残っている可能性あり｡また､ｱｶﾞﾛ-ｽが残っていてもこの様なことになる｡この場合､次のｴﾀ沈で沈澱物をTEsoln.にとかした際
10,000xg､2oC､5分間遠心するとｱｶﾞﾛ-ｽは除ける｡
21.10,000xg､2oC､10分間遠心して上清を完全に除く｡
22.沈澱物を50μlのTEsoln.に溶かす｡(やや溶けにくい場合あり)
(GeneClean Treatment)
23.溶かした液に200μlのNaI液を加え混合後､10μlのｸﾞﾗｽﾐﾙｸを加える｡
24.氷中に10分間放置する｡(ｸﾞﾗｽﾐﾙｸは沈みやすいので時々混ぜてやる)
25.卓上遠心機で30秒間遠心してｸﾞﾗｽﾐﾙｸを落とし上清は捨てる｡
26.700μlのNEWWash液を加えてｸﾞﾗｽﾐﾙｸを完全に懸濁する｡(完全に懸濁することは非常に重要!)
27.卓上遠心機で30秒遠心し上清を除去後､沈澱したｸﾞﾗｽﾐﾙｸを再度700μlのNEWWash液に懸濁する｡
28.(26,27)のWash操作を3回繰り返す｡(3回目の遠心は上清を完全に除くことが重要!)
29.沈澱させたｸﾞﾗｽﾐﾙｸ(上清は完全に除去)を75μlのTEsoln.に懸濁し､55oC､5分間ｲﾝｷｭﾍﾞ-ﾄする｡
30.卓上遠心機で30秒間遠心し､上清のDNA抽出液を別ﾉﾁｭ-ﾌﾞへ移す｡
31.沈澱のｸﾞﾗｽﾐﾙｸは再度75μlのTEsoln.で抽出操作を行う｡抽出液はTotal､150μlとなる｡
32.抽出液に150μlのPhe/Chloを加え充分混合後10,000xg､室温､5分間遠心する｡
33.上層を別のﾁｭ-ﾌﾞへ移し､75μlの(7.5M)NH4oAcと500μlのｴﾀﾉ-ﾙを加え混合後-70oCに保存する｡
*この方法で約10μg/plateのphageDNAが調製できる｡
７．Screening of cDNA from λZAPII library
(用意するもの)
･NET
(5M)NaCl 40ml
(2M)Tris-HCl,pH8.0 5ml
(0.5M)EDTA 4ml
Water up to 60ml
･Denhardt's soln.
Polyvinyl-pyrrolidone 1g
Ficoll 1g
BSA 1g
Water up to 100ml
(ﾌﾟﾛ-ﾌﾞの調製)
1.ﾌﾟﾛ-ﾌﾞにしたいDNA断片をGene clean kitを利用してｱｶﾞﾛ-ｽｹﾞﾙから回収する｡
*私の場合､100ng/μl(水)程度の濃度で調製する｡
2.200ng(2μl)をｴｯﾍﾟﾝﾁｭ-ﾌﾞに取り､滅菌水を加えて58μlとする｡
3.10分間､煮沸する｡
4.氷中で急冷する｡
5.20μlの(x5)ﾊﾞｯﾌｧ-(kit)と10μlのPrimer/BSA(kit)を加える｡
6.10μlの[α-32P]dCTPを加える｡
7.1μlのklenowﾌﾗｸﾞﾒﾝﾄを加え､十分撹拌した後37oC､1時間ｲﾝｷｭﾍﾞ-ﾄする｡
8.反応後､Phe/Chlo抽出する｡
9.ｽﾊﾟﾝｶﾗﾑでfreeの放射能を除く(図1参照)｡
10.上層を別のﾁｭ-ﾌﾞへ移す｡
11.1μlをｻﾝﾌﾟﾘﾝｸﾞし液体ｼﾝﾁﾚ-ｼｮﾝｶｳﾝﾀ-でｶｳﾝﾄしてみる｡
*200,000cpm/μl程度ならOK!!
12.ﾌﾟﾛ-ﾌﾞは-20oCで保存する｡
(ﾌｨﾙﾀｰの調製)
*cDNAまたはｹﾞﾉﾑﾗｲﾌﾞﾗﾘｰからの1stｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞの場合を例にする｡
1.大型丸ﾌﾟﾚｰﾄ(直径15cm)に約3万ﾌﾟﾗｰｸのﾌｧｰｼﾞをまく｡
*15時間程度ｲﾝｷｭﾍﾞｰﾄしできるだけ大きなﾌﾟﾗｰｸをつくらせる｡
2.翌日､ﾌﾟﾗｰｸを形成させたﾌﾟﾚｰﾄを4oCへ置く(約1時間)｡
3.ﾎﾟｰﾙ社製ﾌｨﾙﾀｰ(大型丸)にﾌﾟﾚｰﾄの番号をﾏｰｸする｡
*ﾌｨﾙﾀｰを扱う場合はﾋﾞﾆｰﾙ手袋着用のこと!!
*ﾌﾟﾚｰﾄ1枚につきﾌｨﾙﾀｰは2枚必要｡
4.ﾏｰｸした方を下にしてﾌｨﾙﾀｰをﾌﾟﾚｰﾄの上に置く｡
*1枚目は1分間､2枚目は3分間置く｡
5.ﾌｨﾙﾀｰをﾌﾟﾚｰﾄから剥し変性液の上に置く(5~10分間)｡
*机の上にｻﾗﾝﾗｯﾌﾟをひき､その上に5mlずつ変性液を置いていく｡
そしてこの上にﾌｧｰｼﾞが付いている面を上にしてﾌｨﾙﾀｰを置いていく｡
6.ﾍﾟｰﾊﾟｰﾀｵﾙの上にﾌｨﾙﾀｰを置き変性液を除く｡
7.ﾌｨﾙﾀｰを中和液の上に置く(5~10分間)｡
*方法は変性液の場合と同じ｡
*中和反応は2回行う｡
8.ﾍﾟｰﾊﾟｰﾀｵﾙの上で中和液を十分除いた後､2xSSCの液の上にﾌｨﾙﾀｰを置く(5~10分間)｡
9.ﾍﾟｰﾊﾟｰﾀｵﾙの上で液を除いた後､ﾌｨﾙﾀｰを80oC､2時間熱処理する｡
10.UVﾗﾝﾌﾟ下､7分間放置する｡
11.この状態で保存可能｡
*ﾍﾟｰﾊﾟｰﾀｵﾙにはさんで乾燥した条件下で保存する方がよい｡
(ﾊｲﾌﾞﾘﾀﾞｲｾﾞｰｼｮﾝ)
1.保存しておいたﾌｨﾙﾀｰを3xSSC中で65oC､30分間ｲﾝｷｭﾍﾞｰﾄする｡
2.ﾌｨﾙﾀｰをﾍﾟｰﾊﾟｰﾀｵﾙの上に置き液を除いた後､ﾊｲﾌﾞﾘ用ﾋﾞﾆｰﾙ袋の中にいれる｡
*ﾋﾞﾆｰﾙ袋に入れる際､ﾌｨﾙﾀｰは重ねてもよい｡
*ﾋﾞﾆｰﾙ袋は絶対ﾊｲﾌﾞﾘ用のものを用いること!
3.ﾋﾞﾆｰﾙ袋の中にﾊｲﾌﾞﾘ溶液を入れてﾎﾟﾘｼｰﾗｰでｼｰﾙする｡液量は1.0ml/filter程度でよい｡
(ﾊｲﾌﾞﾘ溶液の調製法:30mlの場合)
ssDNA 1.0ml
water 12.5ml
13.5ml
↓
100oC､10分間
↓
氷中で急冷
↓
add NET 9ml
Denhardt's soln 6ml
(10%)SDS 1.5ml
30ml
*ﾋﾞﾆｰﾙ袋に入れる際､0.45mmﾌｨﾙﾀｰに通すこと!!
これによりﾊﾞｯｸｸﾞﾗｳﾝﾄﾞが落ちる｡
4.ﾊｲﾌﾞﾘの温度(80%程度の相同性ならば55~60oC)で2時間以上ｲﾝｷｭﾍﾞｰﾄする(ﾌﾟﾚﾊｲﾌﾞﾘﾀﾞｲｾﾞｰｼｮﾝ)｡
*ｵｰﾊﾞｰﾅｲﾄでもよい｡
5.ﾊｲﾌﾞﾘのﾋﾞﾆｰﾙ袋の角を一ｶ所ﾊｻﾐで切り､ﾋﾟﾍﾟｯﾄﾏﾝでﾌﾟﾛｰﾌﾞを
入れる｡ﾎﾟﾘｼｰﾗｰでｼｰﾙした後､袋を上下してしっかり混ぜる｡
*ﾌﾟﾛｰﾌﾞの量は200,000cpm/mlを目安とする｡
*ﾌﾟﾛｰﾌﾞは使用直前に100oC､5分間熱処理し､氷中で急冷する｡
6.ﾊｲﾌﾞﾘの温度で20時間程度ｲﾝｷｭﾍﾞｰﾄする｡
7.ﾋﾞﾆｰﾙ袋の隅を切りﾊｲﾌﾞﾘ液を捨て(廃液ﾀﾝｸへ)さらにﾋﾞﾆｰﾙを切り裂いてﾌｨﾙﾀｰを取り出す｡この際､角ﾀｯﾊﾟ容器に4xSSC､0.1%SDSを入れておき､これにﾌｨﾙﾀｰを入れるようにする｡
8.室温で15分間､ﾌｨﾙﾀｰを洗浄する｡ﾋﾟﾝｾｯﾄを使ってﾌｨﾙﾀｰをよくすすぐとよい｡
9.この洗浄操作を2回行う｡
10.4xSSC､0.1%SDS中､ﾊｲﾌﾞﾘ温度で15分間洗浄する｡
*この場合もﾋﾟﾝｾｯﾄでよくすすぐこと｡
*洗浄の目安としてｻｰﾍﾞｲﾒｰﾀｰで1,000cpm/ﾌｨﾙﾀｰ程度まで根気よく続ける｡長時間洗浄してもｶｳﾝﾄが落ちない場合はSSCの濃度を下げて洗浄してみる｡
11.3MM濾紙にﾌｨﾙﾀｰをはり(ｾﾛﾃｰﾌﾟで)､ｻﾗﾝﾗｯﾌﾟで包む｡
ｵｰﾄﾗｶｾｯﾄ(大型)にX線ﾌｨﾙﾑとともに挟みこみー70oCで
50時間程度放置する｡
12.X線ﾌｨﾙﾑを現像しﾎﾟｼﾞﾃｨﾌﾞｼｸﾞﾅﾙの部分をｱｶﾞﾛｰｽﾌﾟﾚｰﾄから
かきとり(直径0.5mm程度)1mlのSMﾊﾞｯﾌｧｰ(50μlのｸﾛﾛﾎﾙﾑ入り)に入れる｡5分間振とうする｡
13.Titer checkをし､小型丸ｼｬｰﾚ(9cm径)に100ﾌﾟﾗｰｸ程度まく｡
以下､1stｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞと同様の方法で2nd､3rdｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞを行い､single cloneを得る｡Good Luck!!
(Plasmid rescue)
1.50μlのﾌｧｰｼﾞ溶液(in SM溶液､titerは10,000plaq-ues/μl程度)と200μlのXL1ーBlue(host cell､
in 10mM MgCl2､OD600=0.5)を15mlのﾌｧﾙｺﾝﾁｭｰﾌﾞに入れ､さらに1μlのﾍﾙﾊﾟｰﾌｧｰｼﾞ(λZAPII kit内にあるもの)を加えて混合後37oC､15分間ｲﾝｷｭﾍﾞｰﾄする｡
2.5mlの2xYT培地を加え(あらかじめ37oCであたためておく)､37oC､5時間振とう培養する｡
*できるだけ激しく振とうする方がよい!
3.70oC､20分間ｲﾝｷｭﾍﾞｰﾄする｡
4.3,000rpm､5分間遠心する｡
5.上清(約5ml)の内の5μlをｴｯﾍﾟﾝﾁｭｰﾌﾞに入れこれに200μlの
XL1ーBlueを加えて混合する｡
*残った上清は4oCに保管しておく｡
6.37oC､15分間ｲﾝｷｭﾍﾞｰﾄする｡
7.ｱﾝﾋﾟｼﾘﾝ(50μg/ml)入りLBﾌﾟﾚｰﾄにまく｡
*ﾌﾟﾚｰﾄは2枚用意し1枚には20μl､もう1枚には150μlまく｡
こうすればｺﾛﾆｰが多すぎてpick upができないということにはならない｡
8.約15時間すればｺﾛﾆｰが見えてくる｡この形質転換体はｸﾛｰﾝﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞを持っているのでｱﾙｶﾘ法でﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞを調製しｲﾝｻｰﾄを調べれば得られたｸﾛｰﾝについての解析が可能｡
クローニング終了