14.Qiagen Tip-100によるplasmid精製（横溝岳彦）
(改訂@1998年3月18日)
取説どおりだとカラムが詰まることが多いので、カラムにかける前に簡単に除タンパクを行う以下の方法をおすすめします。Qiagenで精製したplasmidはDNA sequence, 哺乳動物細胞へのtransfectionにもdirectに使えて便利ですが、一回600円程度かかるので、mapping程度の時はmini-prepにして下さい。(ABIシーケンサーの項参考のこと)
1. 前日50 mlTubeに10 ml TB/Ampを入れてcolonyをinoculateし, 37℃shaking culture。(T-vectorの場合、12時間で約40μg, 24時間で80-120 μg取れます)
2. 大腸菌をPpt down(4000 rpm, 10 min.)。Supは集めて、ハイターを入れてから捨てること。
3. P1を4 ml加え、よくvortexする。（しっかりsuspendすること)
4. P2を4 ml加え、転倒混和で混ぜる。(Vortexすると、genomic DNAが切断されてコンタミする) 室温で5分放置。
5. P3を4 ml加え、転倒混和で混ぜる。タンパク質、debrisが析出する。氷上におく必要はない。
6. クロロフォルム10 ml加え、よく振って除タンパクを行う。
7. P2の遠心機8000 rpm(10000 x g)で10分遠心。
8. SupをあらかじめQBT 4 mlで平衡化したカラムにアプライする。（この際、クロロフォルムや界面のタンパク質を吸わないこと。もったいなくても1-2ml残すようにする)
9. QC 10 mlで二回洗う。
10. 新しいFalcon 15 ml Tubeにカラムをセットし、QF 5 mlで溶出。
11. イソプロピルアルコール 4 ml加え、転倒混和、-20℃ 2時間。(マニュアルでは冷やさないように書いてあるが、少しおいた方が収率はあがる)
12. P2の遠心機8500 rpm(12000 x g)で10分遠心後、Supをデカンテーションで捨て、キムタオルの上に逆さまにして5分くらい置く。
13. TE 100 μlに良く溶かし、エッペンに移す。
14. 10 μl 3M NaoAc, 300 μl EtOHでエタ沈。通常、すぐにDNAが析出するのが見える。見えない場合は-20℃へ。
15. 冷却卓上遠心機15000 rpm 10分、supを捨てる。
16. (Option) 500 μl 70% EtOHを加え、さっと遠心後、Supを完全にのぞく。
17. ふたを空けたまま、室温で2-3分放置し、EtOHをとばす。
18. 50 μl TEに溶かし、うち1 μlを100倍に希釈し、吸光を測る。
19. (Option) 1 μg/μlに希釈して、-20℃で保存。